超微量核酸定量分析儀（如超微量核酸蛋白測(cè)定儀）對(duì)蛋白的測(cè)試主要基于紫外-可見分光光度法，通過測(cè)量蛋白質(zhì)在特定波長(zhǎng)（如280nm）的吸光度來估算其濃度。以下是其測(cè)試蛋白的具體方法及關(guān)鍵步驟：
一、測(cè)試原理
蛋白質(zhì)分子中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）殘基以及Cys-Cys二硫鍵在280nm波長(zhǎng)處有顯著吸收。儀器通過測(cè)量蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度（A280），結(jié)合朗伯-比爾定律，直接計(jì)算蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。此方法無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，但需確保樣品中不含其他在280nm處有強(qiáng)吸收的雜質(zhì)（如核酸、酚類物質(zhì)）。
二、操作步驟
儀器準(zhǔn)備
連接電源，啟動(dòng)儀器，預(yù)熱5-10分鐘至穩(wěn)定狀態(tài)。
選擇“蛋白A280”檢測(cè)模式，并設(shè)置光程（通常為10mm，但儀器可能自動(dòng)調(diào)整）。
使用高純度蒸餾水或空白緩沖液進(jìn)行零點(diǎn)校準(zhǔn)，消除背景干擾。
樣品處理
樣品量：建議使用2μL樣品（部分儀器支持0.5-2μL微量檢測(cè)），確保形成穩(wěn)定液柱。
避免氣泡：點(diǎn)樣時(shí)輕觸檢測(cè)孔底部，緩慢釋放液體，防止氣泡影響吸光度測(cè)量。
表面張力：若樣品表面張力低（如含去污劑），可增加樣品量至4μL以保證液柱穩(wěn)定性。
空白對(duì)照
取2μL空白溶液（如緩沖液）加至下基座，放下上基座并點(diǎn)擊“空白”按鈕，記錄背景吸光度。
擦拭基座，確保無殘留液體。
樣品檢測(cè)
取2μL待測(cè)樣品加至下基座，放下上基座并點(diǎn)擊“樣品”按鈕。
儀器自動(dòng)測(cè)量吸光度并計(jì)算濃度，結(jié)果通常以mg/ml為單位顯示。
高濃度樣品：若吸光值超過儀器量程（如光強(qiáng)<200），需稀釋樣品后重新檢測(cè)。
數(shù)據(jù)記錄與清理
保存檢測(cè)結(jié)果，并導(dǎo)出為CSV或PDF格式。
用無塵布擦拭基座，避免交叉污染。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
基線校準(zhǔn)
默認(rèn)基線校準(zhǔn)波長(zhǎng)為340nm，用戶可根據(jù)需要調(diào)整。
必須在樣品檢測(cè)前完成校準(zhǔn)，否則光譜值將偏移，導(dǎo)致濃度計(jì)算錯(cuò)誤。
樣品純度
避免樣品中含核酸、酚類或高濃度鹽離子，這些物質(zhì)可能在280nm處產(chǎn)生干擾吸收。
若需檢測(cè)含雜質(zhì)樣品，可結(jié)合比色法（如BCA、Bradford法）或使用雙波長(zhǎng)（280nm/340nm）扣除背景。
儀器維護(hù)
光源：避免長(zhǎng)時(shí)間曝光，不使用時(shí)關(guān)閉光源以延長(zhǎng)壽命。
單色器：定期更換干燥劑（如硅膠），防止色散元件受潮生霉。
檢測(cè)器：防止強(qiáng)光直射或受潮積塵，保持清潔。
環(huán)境：儀器應(yīng)放置在干燥、穩(wěn)定的工作臺(tái)上，遠(yuǎn)離空調(diào)出風(fēng)口或直射陽(yáng)光，溫度控制在25℃±2℃。
特殊樣品處理
冷凝樣品：采用45度斜面貼壁緩慢加載，防止溢出或牛頓環(huán)干擾。
多糖類物質(zhì)：檢測(cè)后需用乙醇試劑沖洗液路，避免殘留。
油脂樣品：若發(fā)生上浮現(xiàn)象，需先低溫離心分離后再檢測(cè)。
四、應(yīng)用場(chǎng)景與優(yōu)勢(shì)
快速定量：無需復(fù)雜前處理，2-5分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，適合高通量篩選。
微量檢測(cè)：僅需0.5-2μL樣品，節(jié)省珍貴樣本（如臨床標(biāo)本、稀有蛋白）。
多參數(shù)分析：部分儀器支持同時(shí)檢測(cè)A260（核酸）、A280（蛋白）及OD600（細(xì)菌濃度），實(shí)現(xiàn)多組分定量。
便攜性：緊湊設(shè)計(jì)，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)或移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室。
